后来，郭子兴病死，朱元璋逐渐成为主帅，马氏成为朱元璋的重要参谋之一。朱元璋每次出兵打仗，军中的文书多交给马氏处理。史书记载，马氏仁德慈善，有智计鉴断之能，爱好文史，朱元璋每次出征，文书之类均交马氏管理，即使在紧张仓促之中，马氏也未尝丢弃过。公元1355年，朱元璋率兵从和阳渡江攻太平，和阳空虚，马氏料定元兵必来劫掠义军的家属，便未经请示，就率领义军家属渡过长江。果不出所料，马氏的队伍刚过完，元军就向和阳进攻。
公元1360年，朱元璋同陈友谅会战于南京。当时，陈友谅的势力比朱元璋强大得多，很多人都认为很难取胜，城中人心惶惶，竟有人挖地窑埋藏金银。马氏却把自己的金帛拿出来鼓励将士，激励士气，结果，朱元璋大胜，消灭了陈友谅建立的“大汉”政权。公元1367年，朱元璋又攻克了苏州，俘虏了张士诚，于是，在扫平群雄之后，朱元璋于公元1368年做了大明的开国皇帝，册封马氏为皇后。
马皇后跟随朱元璋南征北战，历尽艰险，不仅常常参与军事，在空闲时间，还带领妇女赶制军衣，可谓竭心尽智，劳苦功高，应算得上“开国皇后”。作为一个女人，这的确是难能可贵的，但最为难得的，是她在建国以后的表现。在她被立为皇后以后，朱元璋曾深情地对她说：“朕起自布衣，得登帝位，外恃功臣，内恃贤后……为朕司书，为朕随军，为朕亲缉甲士衣鞋，种种劳苦，不胜枚举。古称家有良妇，犹国有良相，今得贤惠如后，朕益信古语不虚。”马氏却说：“妾闻夫妇相保易，君臣相保难，陛下不忘妾同贫贱，愿无忘群臣同艰难。”马皇后的明太祖孝慈皇后马皇后像
话，可谓语重心长而又适得其时。
朱元璋把她比做唐代的长孙皇后，马皇后谦辞不敢当，待到朱元璋要把马皇后的宗族故旧请入朝廷，授以爵禄，马皇后叩谢道：“爵禄所以待贤，不应私给外家，妾愿陛下慎惜名器，勿徇私恩。”但朱元璋为了表示对马皇后的感佩之情，还是追封了她的父母，并设庙四时祭拜。马皇后的这番话，不仅令朱元璋倍加感动，就是放在数千年的中国历史上，也不多见，今人听来，尚犹自敬佩。
马皇后起自寒微，一直不忘本色，虽贵为皇后，却过着较为俭朴的生活。平时，她衣不重彩，多穿丝麻织成的练布，过去的破烂衣服什物也总是修补再用。但她并非吝啬，在许多地方，她十分大方。一次，朱元璋视察太学，马皇后听说太学生有几千人之多，便问他们的生活是怎样安排的。当她得知太学生是由国家供应饭食时，便说：“太学生虽免去了饥寒之虞，但他们的家属却不一定有生活保障，希望能给那些家境贫寒的太学生以补助，让他们的妻子老小不至挨饿受冻。”还特别建议设立了红板仓，积聚财物赠送生员的家属，以保证太学生无后顾之忧，安心读书。
朱元璋刚开始制造纸币时，屡次试制都不成功。一天，他梦见有人告诉他说，如果想制成纸币，必须取秀才的心肝才行。梦醒之后他想道：“这难道是让我去杀读书人吗？”马皇后听他说了这个梦，就对皇帝说：“照我看来，秀才们所做的文章，就是他们心肝了。”皇帝听了很高兴，立刻命主管的官署找来秀才们进呈有关文章，加工来用，纸币果然就制造成功了。
在明朝建国初年，宰相胡惟庸谋反案应是最大的谋反案之一，其株连之广，在中国古代史上也是少见的。
中国著名文学家、洪武朝大学士、太子朱标的老师宋濂因年纪已大，早已退隐林泉，离京师千里而居，但他的孙子宋慎知道胡惟庸谋反而未举报，就被株连逮捕到了京城。马皇后听了，连忙跑去对朱元璋说：“听说皇上要处死宋学士，不知是何缘故?”朱元璋说：“宋濂的长孙宋慎知情不报，形同谋反，属大逆不道之罪，按律当诛，且应祸灭九族!”马皇后求情说：“宋学士闲居浦江，早已不问政事，且离京城有千里之遥，根本不知其孙谋反的事，怎么能处他以死刑呢?”朱元璋对谋反之事恨之入骨，所以不听马皇后的劝告，拂袖而去。到了吃晚饭的时候，只见马皇后直落眼泪，朱元璋很奇怪，就问她是什么原因。马皇后说：“宋学士跟随皇上四十多年，德高望重，四海敬仰，又兼满腔赤诚，肝胆照人，如今年逾古稀，却要被刀斧之刑，我哪里能吃得下这珍馐美味?”朱元璋听了这番话，被深深地打动了，就免了宋濂的死刑，改为发配茂州。
所谓“狡免死，走狗烹；高鸟尽，良弓藏；敌国灭，谋臣亡”，这一点，在朱元璋一朝表现得尤为突出，马皇后在谏阻杀戮、保护功臣方面，其做法也可谓前无古人。
建国之初，明朝定都南京，但南京城墙不够坚固完整，朱元璋准备修建，因国库中资金缺乏，朱元璋就向民间募集资金。吴兴人沈秀是一位深藏于江南小镇的富商，用“富可敌国”四字形容，毫不为过。他一生精明盖世，老来却犯了两个大错误：一是他自动捐款要求修半边城墙，二是他修的这半边比朱元璋修的那半边提前完工了三天。本来，朱元璋对沈秀主动要求修半边城墙就大为不满和嫉妒，觉得一个商人竟敢同皇帝平起平坐，且是用钱来修城墙，岂不是为沈秀自己立纪念碑，灭了他皇帝的威风?再加上比皇上提前三天完成，那就更是压倒了皇上，有“欺君之罪”!朱元璋性情忌刻，哪里能容？就找了个借口说沈秀乱掘山脉，把沈秀捕入狱中，准备处死。马皇后知道了此事，急忙前去问询，朱元璋说：“民富敌国，是为不祥。”马皇后抗言道：“国家立法，所以诛不法，非以诛不祥。沈秀虽富可敌国，却并未犯法，为什么要处他死刑呢?”朱元璋理屈词穷，只得把沈秀改谪戍云南，沈秀终于死在贬所，从此，江南富人吸取教训，更加深藏不露。
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